泛瘤种丨精准医疗，免疫治疗的耐药机制
从目前的临床实践应用来看，肺癌靶向治疗[EGFR（18、19、20、21、遗珠、胞外域、复合突变）、ALK、ROS1、RET、MET、HER2、KRAS、BRAF、NTRK、NRG1等]、抗血管生成治疗，免疫治疗（免疫治疗生物标志物、超进展、假性进展，耐药机制），化疗，鳞癌诊疗，小细胞癌诊疗，非小细胞肺癌脑转移，非小细胞肺癌术后辅助治疗（点击阅读）等这几大主题值得探讨，今天我们分享免疫治疗耐药机制。
随着免疫抑制剂应用的广泛以及应用时间增加，如同EGFR-TKI一样，越来越多患者不可避免的出现耐药问题，由于存在耐药性而导致的肿瘤不应答或肿瘤复发再进展，例如在PD-1抑制剂治疗黑色素瘤中，约有60%的患者不响应（primaryresistance），还有一部分患者在初始响应后肿瘤再进展。因此，肿瘤免疫耐药可分为原发性耐药（primary resistance），适应性免疫耐药（adaptive immuneresistance）以及获得性耐药（acquired resistance）。在患者疾病发展过程中由于有多种因素影响抗肿瘤免疫治疗疗效，免疫治疗的耐药问题在将来会成为未来的挑战。
原发性耐药指患者对免疫抑制剂初始治疗就无应答。适应性耐药是指肿瘤会通过免疫系统被识别，但是又通过适应免疫攻击而保护自己产生耐药，适应性耐药可能表现为原发性耐药，但又有部分可能表现为获得性耐药。已有研究表明肿瘤的内在原因和外在原因都与这类耐药机制相关。
肿瘤内在原因肿瘤的内在原因主要是肿瘤细胞上特定基因或通路的表达或上调，从而导致肿瘤微环境中免疫细胞的浸润以及功能受到抑制，使得免疫治疗出现原发性或适应性耐药。
1.肿瘤抗原免疫治疗依赖于肿瘤抗原特异的T细胞，缺少肿瘤抗原，从而导致无法激活T细胞，这是对免疫治疗无应答最直接的原因。在人黑色素瘤、肾细胞癌、非小细胞肺癌中，DNA突变频率高，肿瘤免疫原性强，因而对抗PD-1疗法响应更好。而在胰腺癌以及前列腺癌中，DNA突变频率低，肿瘤免疫原性低，对抗PD-1治疗反应差。此外，突变负荷也与免疫治疗在特定肿瘤类型中的疗效相关。
另一方面，抗原提呈机制存在缺陷或被破坏也会引起原发性耐药，表达肿瘤抗原的癌细胞可通过改变β-2-微球蛋白（β2M）或主要组织相容性复合体（MHC）本身破坏抗原提呈过程。在某些情况下，由于抗原加工过程中的蛋白酶体成员、转运蛋白、MHC本身以及β-2-微球蛋白（β2M）的功能缺陷，会导致抗原提呈机制不能有效地将肿瘤抗原提呈到细胞表面。已有研究探索了在黑色素瘤中由于β2M缺失，使得对T细胞浸润能力丧失。β2M在HLA I家族的折叠与转运到细胞膜的过程中发挥关键作用，若其丧失功能，则CD8+T细胞失去了识别功能。而且，一些表观遗传修饰的改变如过甲基化和组蛋白乙酰化都会破坏MHC介导的抗原加工、提呈过程以及免疫逃逸。β2M基因编码β-2-微球蛋白，是主要组织相容性复合物（MHC）Ⅰ类分子复合物的重要组成部分，β2M突变导致HLA缺失，HLA的多样性减少，无法实现抗原呈递，CD8+T细胞失去识别功能，形成原发性耐药。
IFN-γ信号通路是免疫治疗耐药形成的一个关键通路，会导致原发性、适应性和获得性耐药。IFN-γ通路对抗肿瘤免疫治疗同时有有利和不利两方面。有利：由肿瘤特异T细胞产生的IFN-γ，能够识别同源的肿瘤细胞或抗原递呈细胞上的相应受体，从而发挥有效的抗肿瘤免疫响应。IFN-γ还可以能够增强MHC分子的表达，从而增强肿瘤抗原提呈作用。IFN-γ也能够招募其他的免疫细胞，或者直接抑制肿瘤细胞的增殖，促进其凋亡。不利：持续的IFN-γ暴露会导致癌症细胞重新免疫编辑而产生免疫逃逸。因此IFN-γ通路上的分子表达减少或者分子突变，表观遗传沉默都会使IFN-γ失去抗肿瘤作用。肿瘤细胞通过IFN-γ受体链JAK1与JAK2、信号转到分子及转录激活分子（STATS）的突变或减少表达以逃脱IFN-γ效应。此外，有一项临床前研究探索在CRISPR模型下内源性配体突变，与JAK1相互作用后调节IFN-γ反应，通过IFN-γ阻断使得对PD-1抑制剂原发性耐药。而且，在另一种CRISPR模型中，酪氨酸蛋白磷酸酶非受体类型2（PTPN2）激活突变会负性调节JAK1和STAT1信号，由于IFN-γ被抑制而出现原发性耐药，因此，在黑色素瘤模型中通过CRISPR-Cas9基因编辑使PTPN2 缺失可以重建IFN-γ敏感。
肿瘤的外在原因
外在原因是由于肿瘤微环境中一些成员发挥抗免疫治疗反应的抑制作用，主要包括调节T细胞Tregs，髓样抑制细胞MDSCs，M2巨噬细胞，其他的抑制性免疫检查点与抑制性细胞因子和吲哚-2, 3-加双氧酶（IDO）等。主要介绍以下几点机制：
1. 调节T细胞Tregs
Tregs能通过分泌抑制性细胞因子如IL-10、IL-35和TGF-β或者通过直接细胞接触来抑制效应T细胞Teffs的反应。许多人肿瘤中发现了浸润的Tregs，且鼠模型中去除肿瘤微环境中的Tregs能够显著提高免疫治疗疗效。PD-1/PD-L1抑制剂的疗效与Teff和Treg比例增加相关。这都说明肿瘤微环境中如果没有Teff的增加和Treg减少会对免疫治疗产生耐药。
2. 髓源性抑制细胞（MDSCs）
MDSCs在多种病理条件下发挥着免疫调节因子的作用。MDSCs能够促进血管生长，肿瘤侵袭与转移。肿瘤微环境中MDSCs的存在与降低生存率以及免疫检查点抑制剂治疗疗效相关。研究发现在老鼠模型中，PI3K抑制剂可以增强促炎性细胞因子表达和抑制免疫抑制因素，与抗PD-1联用表现出良好的肿瘤抑制效果。
3. 肿瘤相关的巨噬细胞（TAMs）
TAMs包括M1巨噬细胞和M2巨噬细胞，在大多数情况下M2巨噬细胞占TAMs的大多数。其中M1巨噬细胞能够高表达IL-12，IL-23，MHC以及B7家族分子来促进抗原提呈与Th1细胞的激活，从而发挥抗肿瘤免疫作用；而M2巨噬细胞能够分泌抑制性细胞因子IL-10与TGF-β，从而抑制免疫治疗与促进肿瘤生长与转移。因此，临床上TAMs的数目越多，肿瘤预后就越差。临床前研究探索巨噬细胞集落刺激生长因子受体1（CSF-1R）抑制剂，能够显著减少TAMs数目，抑制肿瘤生长。
4. 肿瘤浸润细胞上CD28的表达
CD28是T细胞的共刺激分子，对于T细胞的激活、增殖和存活起到关键作用。在人出生时，所有T细胞都会表达CD28，但是CD28的表达量会随着年龄的增加而下降。CD28-T细胞产生的主要原因是重复的抗原刺激。最近，Science上发表了一项研究，他们发现CD28对于耗尽的CD8+T细胞再激活是必须的。在老鼠模型中，阻断CD28-B7共刺激通路，会影响肿瘤特异CD8+T细胞的增殖和激活，降低对抗PD-1/PD-L1的疗效。说明了CD28共刺激对于肿瘤浸润的PD-1+CD8+T细胞增殖与再激活有关键的作用。因此，CD28的表达与PD-1抑制剂疗效相关。
获得性耐药机制获得性耐药是指在免疫治疗时表现为肿瘤应答，同时在一段长时间治疗后出现疾病复发或进展。由于免疫治疗一个显著特点就是肿瘤响应时间长，但在使用抗PD-1治疗黑色素瘤患者中，大约有1/4-1/3的患者在经历初始响应后出现了肿瘤进展，即获得性耐药。获得性耐药的产生可能是因为在治疗过程中出现了上文所述的关于原发性或适应性耐药原因，包括T细胞功能的丧失，肿瘤抗原提呈出现缺陷以及其他一些新突变的产生。例如，在一类抗PD-L1治疗较长时间后出现获得耐药性的病人中，发现了β2M突变，从而导致抗原提呈机制缺陷。在另两例获得性耐药患者中，发现了IFN-γ通路中JAK1或JAK2发生了突变。目前，也发现了其他获得性耐药机制，不同于原发性或适应性耐药机制。
CD8+T细胞上的PD-1表达是作为持续的抗原刺激，这种刺激会导致损害效应T细胞功能。PD-1抑制剂可以重新建立耗竭的CD8+T细胞而产生抗肿瘤效应作用。但是，重建的耗竭型T细胞与肿瘤负荷的总体比例会影响临床对于PD-1抑制剂的疗效。如果耗竭的T细胞在重建后没能够清除肿瘤，而肿瘤负荷在治疗后仍很大，最终就会导致再次耗竭。另一方面，PD-1抑制剂促使效应T细胞重新复苏激活而不是记忆T细胞，但记忆T细胞有更大的增殖能力和对肿瘤应答时间更长，所以再次耗竭T细胞和缺乏记忆T细胞就会导致免疫治疗后的进展。因此，在将来是否可以探索一种可以持续更长时间的抗肿瘤免疫治疗也非常关键。
此外，在2016年Nat Commun上首次报道抗PD-1免疫治疗发生耐药的主要机制是选择性激活新的免疫检查点TIM-3从而导致免疫逃逸。同样地，在抗PD-1治疗后再次出现T细胞耗竭，分析了T细胞功能相关的免疫检查点分子表达状态，就发现在两个老鼠肿瘤模型中，耐药后与给药前相比，肿瘤浸润的T细胞而非外周血或脾脏T细胞上的TIM-3表达量显著上调，且TIM-3表达量上调的主要是那些结合了抗PD-1抗体的T细胞，两例抗PD-1治疗后出现获得性耐药的非小细胞肺癌肿瘤样本中，也观察到了TIM-3而非其他抑制性免疫检查点的表达量显著升高。需注意的是TIM-3表达量升高在抗CTLA-4中并未检测到。此外，肿瘤细胞上TIM-3配体Galectin-9的表达量也显著升高。当PD-1抑制剂治疗出现耐药后，联用抗TIM-3，可以提高生存率。而当抗PD-1和抗TIM-3联用后出现耐药，那些结合了抗PD-1和抗TIM-3抗体的T细胞上，其他抑制性免疫检查点如CTLA-4，LAG-3的表达量明显升高。这说明了肿瘤浸润T细胞的抑制性免疫调节是动态变化的，存在着补偿效应。这也说明抗PD-1和抗TIM-3联用时可以改善对PD-1抑制剂治疗后出现获得性耐药病人的生存，在未来或许不同免疫抑制剂联用是一种解决PD-1耐药的有效治疗策略。
除了与原发性耐药相似的β2M突变，JAK1或JAK2突变导致的获得性耐药外，其他一些新抗原的缺失会导致免疫治疗的获得性耐药。有研究表明在黑色素瘤免疫治疗中，炎性应激反应会诱导黑色素瘤细胞去分化，增强了神经生长因子受体表达和减少了黑色素瘤抗原的表达如MART-1。在非小细胞肺癌中的研究也发现那些对PD-1/PD-L1抑制剂获得性耐药的患者会缺失在治疗时有的很多突变相关新抗原。这些治疗前存在的突变抗原比在疾病进展时剩下的抗原有更强的促进MHC结合的亲和力。因此，进一步了解这些新抗原是如何改变的，或者说是动态监测新抗原的分类可能可以及早发现免疫治疗出现耐药的情况。
其 他PBRM1编码SWI/SNF 染色质重塑复合物 PBAF亚型的一个亚基,与肾透明细胞癌的发生发展密切相关。在肾癌中，研究者发现，携带PBRM1失活突变的肾癌患者，使用PD-1抑制剂的有效率更高，OS更长。PBRM1基因失活突变会上调JAK/STAT通路、低氧通路和免疫信号通路基因的表达，可能改变了肿瘤细胞的整体表达谱，从而影响免疫检查点抑制剂的疗效。肺腺癌→小细胞肺癌
肺腺癌向小细胞肺癌（SCLC）转化是表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKI）的耐药机制之一，但肺腺癌经免疫治疗后罕有病例会出现转化。但有研究发现，经过纳武利尤单抗治疗后有2例KRAS突变肺腺癌患者发生了小细胞肺癌转化。
案例一
女性患者，67岁，有吸烟史50包/年。确诊为KRASG12C突变肺腺癌。一线治疗为卡铂紫杉醇，有效，无进展生存为19个月。首次进展时患者拒绝接受活检，直接接受纳武利尤单抗（Nivolumab）治疗。患者在接受第36个周期的纳武利尤单抗治疗后的2周，疾病再次出现广泛进展，出现心包积液伴心脏压塞，需行心包穿刺术。胸腔或心包积液细胞学检查提示小细胞肺癌可能。积液癌细胞二代测序技术（NGS）检测并发现没有KRAS突变，而出现TP53 S315S移码突变和RB1基因的剪接位点突变。随后该患者接受了卡铂、依托泊苷和紫杉醇联合治疗，该患者在小细胞肺癌转化后的第11个月，即初诊后第4年死亡。
案例一
案例二
案例二
女性患者，75岁，有吸烟史30包/年，诊断为KRAS G12C突变肺腺癌。一线卡铂、紫杉醇和贝伐珠单抗治疗有效，在诊断后的第24个月后出现疾病进展，组织再活检显示肺腺癌。患者开始接受33个周期的纳武利尤单抗治疗，根据RECICST 1.1疗效评价为稳定。经过11个月的治疗，患者出现无症状疾病进展，活检证实为小细胞肺癌转化。同时外周血游离DNA（cfDNA）分析显示，KRAS G12C突变的等位基因频率（AF）为19.47%，TP53 R273C突变的AF为0.55%，未检测到RB1突变。之后患者依次接受卡铂依托泊苷、纳武利尤单抗伊匹单抗和伊立替康单药治疗。该患者在小细胞肺癌转化后的第16个月，即初诊后第5.5年死亡。
随着免疫治疗进入新时代，找出有效的生物标记来预测免疫治疗疗效及耐药非常关键。目前发现的生物标记包括基因组标志物、免疫调节基因表达量、CD8+T细胞的密度和分布、PD-L1表达在内的免疫标志物等。而总肿瘤突变负荷是至今认为最好的预测免疫治疗疗效的生物标志物。对于监测耐药，最近研究表明相对于治疗前的标记物，在治疗的早期样本的免疫标记物能更好地预测疗效。因此，纵向的多次动态活检在整个治疗过程中可能会更好地预测肿瘤对治疗的应答情况，可以达到个体化治疗的目标。
此外，应对肿瘤免疫耐药的一个有效方法就是联合用药。已有研究显示抗PD-1与抗CTLA-4联合用药治疗转移性黑色素瘤有很好的疗效。以及抗PD1与抗TIM-3/抗LAG-3/抗TIGIT的联合用药在临床前实验都展示出了极佳的效果，临床试验也正在进行中。除了不同免疫抑制剂的联用，与共刺激因子激动剂，分子靶向药，放疗化疗以及表观遗传修饰因子的联用都在临床研究中。还有一些观点是探索代谢重新改编T细胞程序和通过调整消化道菌群来增强治疗的疗效。这样就可以将肿瘤“冷”微环境转化为“热”微环境，以此改变免疫治疗的疗效，使其能够达到更好的疗效和更长的持续治疗时间。
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